Společnost ELISABETH PHARMACON nabízí sekvenování DNA na zakázku. Sekvenace je prováděna na vlastním přístroji ABI3130 v brněnských laboratořích zkušenými odborníky na DNA diagnostiku.

Věnujte prosím velkou pozornost přípravě vzorků na sekvenování, neboť jejich špatná kvalita nebo nízká koncentrace je nejčastější příčinou selhání sekvenační reakce. Následující informace by měly napomoci k co nejlepším výsledkům sekvenace.

1) Koncentrace a objem vzorků
Do sekvenační reakce je zapotřebí podstatně více vstupního množství templátu než do PCR reakce. V tabulce 1 jsou uvedeny minimální koncentrace a objemy vzorků pro jednu obousměrnou sekvenaci. Primery by měly mít koncentraci minimálně 5 umol/l. V případě, že vzorky přečišťujete, provádějte odečet jejich koncentrace až po jejich přečištění.

Koncentraci doporučujeme určovat pomocí UV-spektrofotometru (NanoDrop) nebo na základě odečtu z gelové elektroforézy srovnáním se známým standardem o srovnatelné velikosti. Před vlastní sekvenací koncentraci vzorku ještě jednou kontrolujeme a pokud bude ve vzorcích nízká koncentrace nebo kvalita DNA, budete požádání o zaslání nových vzorků o vyšší koncentraci.

Tab. 1 Minimální množství vzorků a primerů potřebných pro jednu obousměrnou sekvenaci

2) Kvalita vzorků
- Přítomnost vedlejších produktů, prázdných vektorů, RNA, proteinů nebo jiných nečistot výrazně zhoršuje kvalitu sekvenování. V takovém případě je vhodné vzorky přečistit.

- Po přečištění vzorky rozpouštějte v PCR vodě, nikdy ne v TE pufru!!!

- Exo-SAP metodu lze použít pouze tehdy, je-li na gelu pouze jeden zřetelný produkt

4) Další informace
• vzorky a primery označte co nejjednodušeji
• pokud víte nebo tušíte, že Váš vzorek obsahuje některá hůře sekvenovatelná místa (úseky bohaté na GC nebo AT, dlouhé repeaty, dlouhé homopolymerní úseky apod.), upozorněte nás na to
• pokud je nízká výtěžnost PCR reakce v důsledku horšího nasedání primerů, upozorněte nás na to
• u prvních 50 bazí nezaručujeme čitelnost sekvence (pozor při navrhování primerů)
• termín dodání výsledků je zpravidla 7 dní.
• za dostatečnou koncentraci a kvalitu vzorků zodpovídá zákazník a při analýzách vycházíme z údajů uvedených v průvodce